Spektrofotometrin absorbanssilla tarkoitetaan liuoksen absorboimaa valomäärää mitattuna laboratoriolaitteella, jota kutsutaan absorbanssispektrofotometriksi. Kemiassa ja biologiassa spektrofotometrejä käytetään eri tarkoituksiin. Ne voivat auttaa tunnistamaan yhdisteitä, määrittämään liuosten pitoisuuksia tai arvioimaan nesteeseen suspendoituneiden solujen lukumäärän. Spektrofotometrit toimivat ohjaamalla suodatettu joukko tiettyjä aallonpituuksia valoa näyteliuoksen läpi ja valomittarille. Näytteen lähettämän tai absorboiman valon määrä sekä absorboidut aallonpituudet paljastavat joitain näytteen ominaisuuksia.
Valo, jonka ihmiset havaitsevat visuaalisesti, on eräänlainen energia, sähkömagneettinen säteily, ja se sisältää aallonpituuksien alueen pienellä osalla sähkömagneettista spektriä. Gammasäteet, röntgensäteet ja muut lyhyet aallonpituudet alle 400 nanometriä (nm) eivät näy ihmissilmälle eivätkä aallonpituudet, jotka ovat pidempiä kuin 700 nm, kuten infrapuna- tai radioaaltoja. Ihmisten näkemät värit vaihtelevat lyhyemmistä sinisistä ja violetista aalloista noin 400 nm: n läpi sateenkaaren punaiseen, joka on lähempänä 700 nm. Spektrofotometrit mittaavat näkyvällä alueella ja ovat hieman päällekkäisiä spektrin ultravioletti- ja infrapunaosuuksiin.
Kun näemme värin, esimerkiksi vihreän lehden, näemme kyseisen kohteen lähettämät valon aallonpituudet. Vihreän lehden tapauksessa kasvien soluissa oleva yhdiste, nimeltään klorofylli, absorboi sinistä ja punaista aallonpituutta auringon valkoisesta valosta, mutta ei absorboi vihreää voimakkaasti. Sen sijaan vihreitä ja lähes vihreitä aallonpituuksia lähetetään, ja kasvi näyttää vihreältä.
Missä tahansa nestemäisessä liuoksessa jotkut valon aallonpituudet absorboituvat suurempia määriä kuin toiset. Spektrofotometrit ohjaavat valkoisen valonsäteen tutkittavan näyteliuoksen läpi. Spektrofotometrin absorbanssi on valon määrä, jonka tutkittu yhdiste absorboi. Tämä valo absorboituu vaihtelevina määrinä eri aallonpituusalueilla, jotka tunnetaan absorptiospektrinä.
Absorptiospektri voi auttaa tunnistamaan näyteyhdisteen. Esimerkiksi jotkut kasvipigmentit absorboivat eri aallonpituuksia kuin klorofylli ja ne voidaan erottaa toisistaan niiden absorptiotaulukoiden avulla – kaaviot, joissa spektrofotometrin absorbanssi näytetään aallonpituuden funktiona. Suurimmat absorboituneet aallonpituudet näkyvät kaaviossa piikkeinä, jolloin kunkin yhdisteen kuvaajalle on ominainen muoto.
Liuoksen pitoisuus voidaan myös päätellä sen spektrofotometrin absorbanssista. Tämä tehdään Lambert-Beer-lain, joka tunnetaan myös nimellä Beerin laki, kautta, joka on yhtälö, joka liittyy spektrofotometrin absorbanssitasoon pitoisuuteen kahden muun tekijän kautta: sukupuuttokerroin ja reitin pituus tai näyteputken leveys. Ekstinktiokerroin on kemiallinen tekijä, joka on erilainen kullekin yhdisteelle, mutta se voidaan määrittää testaamalla näytte, jonka pitoisuus on tunnettu spektrofotometrillä. Olutlakia voidaan käyttää ratkaisemaan saman yhdisteen tuntemattomat pitoisuudet.