Agaroosigeeli on aine, jota käytetään biokemiassa ja biotekniikassa geelelektroforeesissa ja koon poissulkukromatografiassa, jotka ovat menetelmiä suurten molekyylien lajittelemiseksi niiden koon ja sähkövarauksen mukaan. Nämä prosessit käyttävät agaroosia erottamaan ja analysoimaan proteiineja ja DNA: ta. Se sopii hyvin näihin sovelluksiin sen molekyylirakenteen vuoksi, jonka ansiosta erikokoiset molekyylit voivat liikkua sen läpi eri nopeuksilla. Materiaali saadaan erilaisista merilevistä, ja sitä löytyy yleensä laboratorioista jauheena. Tietyn testin kannalta sopivan väliaineen valmistamiseksi jauhe lisätään veteen sopivassa pitoisuudessa, keitetään ja annetaan sen jälkeen jäähtyä geeliksi.
Valmistus
Agaroosia uutetaan agarin muodossa useista punaisten merilevien eli merilevien lajeista, joita löytyy Kaliforniasta ja Itä -Aasiasta. Agar, termi, joka on peräisin malaijilaisesta sanasta agar-agar, joka tarkoittaa hyytelöä, saadaan tyypillisesti Gelidium-tyyppisistä merilevistä. Se koostuu kahdesta eri aineesta, jotka tunnetaan nimellä agaroosi ja agaropektiini, ja tukee merilevien soluseinämiä. Kun agar on poistettu, sitä voidaan käyttää elintarvikkeiden sakeuttamisaineena, aivan kuten gelatiini, tai laksatiivina. Jos se on puhdistettu, sitä voidaan käyttää väliaineena bakteerien, sienien tai muiden mikro -organismien kasvattamiseen.
Agaroosin erottaminen agaropektiinistä agarissa on melko helppoa, koska agaroosimolekyylit sitoutuvat voimakkaasti toisiinsa, kun taas agaropektiini geeliytyy huonosti. On olemassa useita menetelmiä agaroosin eristämiseksi. Yhdessä menetelmässä agariin lisätään karrageeni, toinen punaisesta merilevästä löydetty molekyyli ja suola. Tämä saa agaropektiinin saostumaan tai muodostamaan kiinteän aineen, joka voidaan poistaa agar -liuoksesta. Toinen menetelmä lisää pektinaasientsyymiä, kemikaalia, joka hajottaa agaropektiinin, jolloin se liukenee veteen.
Geelielektroforeesi
Agaroosigeeli liittyy yleisimmin elektroforeesiin. Tässä menettelyssä tutkijat käyttävät sähkökenttää liukenevaa DNA: ta, RNA: ta tai proteiinifragmentteja sisältävän materiaalin laatan poikki. Tämä saa nämä suuret molekyylit liikkumaan sähkövaraustensa vuoksi: positiivisesti varautuneet tyypit siirtyvät kohti negatiivista puolta ja päinvastoin. DNA- ja RNA -fragmenteilla on negatiivinen varaus, joten ne siirtyvät kohti positiivista loppua, kun taas proteiinifragmentit voivat olla joko negatiivisia tai positiivisia.
Nopeus, jolla molekyylit liikkuvat, riippuu niiden koosta ja niiden varauksesta. Agaroosigeeli on rakennettu siten, että se muodostaa eräänlaisen verkon, jossa on reikiä, joiden läpi muut molekyylit voivat kulkea. Pienemmillä on helpompi kulkea reikien läpi, joten ne kulkevat nopeammin. Suuremmista molekyyleistä muodolla on myös osuutensa, koska pienemmät molekyylit kulkevat helpommin läpi. Tekniikkaa käytetään sekä näytteiden analysointiin että tiettyjen DNA -sekvenssien eristämiseen käytettäväksi bioteknisissä sovelluksissa.
Ennen elektroforeesia DNA-näyte käsiteltäisiin erityisillä entsyymeillä, jotka katkaisivat pitkät, säikeen kaltaiset molekyylit tietyissä paikoissa ja tekivät pienempiä fragmentteja. Agaroosigeeli valmistetaan liuottamalla jauhe puskuriliuokseen, joka kestää pH: n (happamuus/emäksisyys) muutoksia, jotka muutoin voivat johtua sähkökemiallisista vaikutuksista. Eri määriä jauhetta käytetään eri molekyylialueille, mutta yleensä pitoisuus on 0.7-1.2%. Fluoresoiva väriaine nimeltä etidiumbromidi lisätään yleensä tässä vaiheessa, koska se värjää DNA: ta ja tekee siitä helposti näkyvän ultraviolettivalossa. Tämä seos mikroaaltouunissa ja annetaan kovettua.
DNA -näytteet laitetaan geelin pieniin kuoppiin ja sen päälle syötetään suora sähkövirta. Eri kokoiset molekyylit kulkevat geelin poikki eri nopeuksilla, joten tietyn ajan kuluttua ne näkyvät eri paikoissa pienemmät fragmentit edelleen kohti positiivista loppua. Tämän avulla tutkijat voivat määrittää fragmenttien koot ja eristää erilaiset DNA -sekvenssit.
Muuhunkin
Agaroosigeeliä käytetään joskus siihen liittyvään tekniikkaan, joka ei sisällä sähköä, joka tunnetaan nimellä koon poissulkukromatografia. Tässä menetelmässä lasipylväs pakataan geelistä valmistetuilla helmillä ja kaadetaan liuos, joka sisältää erikokoisia molekyylejä. pienempiä hidastuu helmissä. Tämä johtuu siitä, että pienillä molekyyleillä on taipumus imeytyä geelin huokosiin, kun taas suuret ovat liian suuria päästäkseen näihin huokosiin ja pyrkivät sen sijaan virtaamaan helmien väliin. Geelityyppi ja konsentraatio voidaan säätää erotettavan molekyylin koon mukaan.