Konfokaalimikroskooppi on erityinen fluoresoiva mikroskooppi, jota käytetään korkealaatuisten 2D- ja 3D-kuvien saamiseen. Perus (laajakenttä) fluoresoivalla mikroskoopilla tietyn aallonpituuden valo loistaa näytteeseen, ja näyte absorboi osan valosta ja heijastaa loput aallonpituudelta. Pidempi aallonpituusvalo kulkee dikroisen peilin läpi, mikä mahdollistaa pidemmän aallonpituuden valon, mutta ei alkuperäisen (lyhyemmän) aallonpituuden valon. Näytettä katsova henkilö näkee vain valon, joka on kulkenut dikroisen peilin läpi. Perusfluoresoivat mikroskoopit sieppaavat sekä tarkennettuja että epätarkkoja valoja, mikä toimii hyvin suurissa näytteissä, joissa ei vaadita erittäin suurta tarkkuutta. Se ei toimi niin hyvin hienojen yksityiskohtien katsomiseen. Korkean resoluution fluoresoivien kuvien ottamiseen tarvitaan konfokaalimikroskooppi.
Konfokaalimikroskooppi käyttää neulareikää tarkennusvalon hylkäämiseksi. Sen sijaan, että valo kulkisi vain dikroisen peilin läpi, valo kulkee sekä dikroisen peilin että neulareiän läpi, mikä tarkoittaa, että näytettä katsova henkilö näkee vain yhden pisteen näytteestä. Koko näytteen katsomiseksi liikkuvat peilit skannaavat valoa näytteen suorakulmaisen tason poikki ja tietokone kerää säteilevän valon näytteen skannatessa. Täydellinen skannaus johtaa näytteen optiseen viipaleeseen tai poikkileikkaukseen. Tämän tyyppistä mikroskopiaa kutsutaan konfokaalisiksi laserskannausmikroskopioiksi, osittain siksi, että valonlähteenä käytetään laseria.
3D -kuvan luomiseksi tehdään useita skannauksia ja näytteestä luodaan useita ”viipaleita”, ja tietokone yhdistää kunkin viipaleen kolmiulotteisen kuvan luomiseksi. Mikroskooppi voidaan ohjelmoida vaihtamaan viipaleiden välistä tilaa riippuen siitä, kuinka terävän 3D -kuvan käyttäjä haluaa saada. Mikroskooppi voi myös vaihdella kuvan skannausnopeutta, ja hidas skannaus antaa paremman resoluution kuin nopea skannaus.
Konfokaalisesta mikroskoopista on tullut erittäin yleisesti käytetty laite monissa biotieteellisissä laboratorioissa. Ne ovat kalliita ja hieman suuria, ja niissä on usein omistettu huoneita, koska huoneen on oltava pimeä hyvän fluoresoivan kuvan saamiseksi. Vaikka konfokaalimikroskooppeja käytetään yleisimmin solujen ja solujen rakenteiden tarkastelemiseen, niitä voidaan käyttää kuvan saamiseen mistä tahansa kolmiulotteisesta fluoresoivasta näytteestä, ja niitä käytetään joskus puolijohdemateriaalien katseluun.