Spektrofotometri on yksi tieteellisistä välineistä, joita yleisesti löytyy monista tutkimus- ja teollisuuslaboratorioista. Spektrofotometrejä käytetään fysiikan, molekyylibiologian, kemian ja biokemian laboratorioiden tutkimukseen. Tyypillisesti nimi viittaa ultraviolettinäkyvään (UV-Vis) spektroskopiaan.
Valon energia riippuu sen aallonpituudesta, yleensä nimellä lambda. Vaikka sähkömagneettinen spektri ulottuu valtavalle aallonpituusalueelle, useimmat laboratoriot voivat mitata vain pienen osan niistä. UV-Vis-spektroskopia mittaa 200–400 nanometriä (nm) UV-valon mittauksissa ja jopa noin 750 nm näkyvissä spektreissä.
UV-Vis-spektroskopiaa varten näytteet yleensä säilytetään ja mitataan pienissä säiliöissä, joita kutsutaan kyveteiksi. Nämä voivat olla muovisia, jos niitä käytetään näkyvissä spektreissä, mutta niiden on oltava kvartsia tai sulatettua piidioksidia, jos niitä käytetään UV -mittauksiin. Jotkut koneet voivat käyttää lasikoeputkia.
Näkyvää spektroskopiaa käytetään usein teollisesti kolorimetriaan. Tätä menetelmää käyttäen näytteet mitataan useilla aallonpituuksilla 400-700 nm, ja niiden absorbanssiprofiileja verrataan standardiin. Tätä tekniikkaa käyttävät usein tekstiili- ja mustevalmistajat. Muita UV-Vis-spektroskopian kaupallisia käyttäjiä ovat oikeuslääketieteelliset laboratoriot ja tulostimet.
Biologisessa ja kemiallisessa tutkimuksessa liuokset kvantifioidaan usein mittaamalla niiden valon absorptiotaso tietyllä aallonpituudella. Yhdisteen pitoisuuden laskemiseen käytetään arvoa, jota kutsutaan sukupuuttokerroimeksi. Esimerkiksi molekyylibiologian laboratoriot käyttävät spektrofotometrejä DNA- tai RNA -näytteiden pitoisuuksien mittaamiseen. Heillä on joskus edistynyt kone, nimeltään NanoDrop ™ -spektrofotometri, joka käyttää murto -osan näytteen määrästä verrattuna perinteisiin spektrofotometreihin.
Jotta määritys olisi pätevä, näytteen on noudatettava Beer-Lambert-lakia. Tämä edellyttää, että absorbanssi on suoraan verrannollinen kyvetin reitin pituuteen ja yhdisteen imeytymiseen. On olemassa taulukoita sukupuuttokerroimista monille yhdisteille, mutta ei kaikille.
Monet kemialliset ja entsymaattiset reaktiot muuttavat väriä ajan myötä, ja spektrofotometrit ovat erittäin hyödyllisiä näiden muutosten mittaamiseen. Esimerkiksi polyfenolioksidaasientsyymit, jotka saavat hedelmät ruskeutumaan, hapettavat fenoliyhdisteiden liuoksia ja muuttavat kirkkaat liuokset näkyvästi värillisiksi. Tällaiset reaktiot voidaan määrittää mittaamalla absorbanssin lisääntyminen värin muuttuessa. Ihannetapauksessa muutosnopeus on lineaarinen, ja näistä tiedoista voidaan laskea hinnat. Edistyneemmässä spektrofotometrissä on lämpötilasäädetty kyvettiteline, joka suorittaa reaktiot tarkassa lämpötilassa, joka on ihanteellinen entsyymille.
Mikrobiologiset ja molekyylibiologian laboratoriot käyttävät usein spektrofotometriä bakteeriviljelmien kasvun mittaamiseen. DNA -kloonauskokeita tehdään usein bakteereissa, ja tutkijoiden on mitattava viljelmän kasvuvaihe tietääkseen, milloin tietyt toimenpiteet on suoritettava. Ne mittaavat spektrofotometrillä absorbanssin, joka tunnetaan nimellä optinen tiheys (OD). OD: sta voidaan päätellä, jakautuvatko bakteerit aktiivisesti vai alkavatko ne kuolla.
Spektrofotometrit käyttävät valonlähdettä loistaa aallonpituusjoukon monokromaattorin läpi. Tämä laite lähettää sitten kapean valon kaistan, ja spektrofotometri vertaa näytteen läpi kulkevaa valon voimakkuutta vertailuyhdisteen läpi kulkevaan valon voimakkuuteen. Esimerkiksi jos yhdiste liuotetaan etanoliin, viite on etanoli. Tulos näytetään niiden välisen eron absorptiotasona. Tämä osoittaa näyteyhdisteen absorbanssin.
Syynä tähän absorbanssiin on se, että sekä ultraviolettivalolla että näkyvällä valolla on tarpeeksi energiaa kiihottaakseen kemikaaleja suuremmille energiatasoille. Tämä viritys johtaa korkeampaan aallonpituuteen, joka näkyy, kun absorbanssi piirretään aallonpituutta vastaan. Eri molekyylit tai epäorgaaniset yhdisteet absorboivat energiaa eri aallonpituuksilla. Ihmissilmä näkee ne, joilla on suurin imeytyminen näkyvällä alueella.
Yhdisteiden liuokset voivat olla kirkkaita, mutta absorboivat UV -alueella. Tällaisilla yhdisteillä on yleensä kaksoissidoksia tai aromaattisia renkaita. Joskus on yksi tai useampi havaittavissa oleva huippu, kun absorptiotaso piirretään aallonpituutta vastaan. Jos näin on, tämä voi auttaa joidenkin yhdisteiden tunnistamisessa vertaamalla kaavion muotoa tunnettujen vertailutilojen muotoon.
UV-Vis-spektrofotometrikoneita on kahdenlaisia, yksi- ja kaksisäteinen. Nämä eroavat toisistaan siinä, miten ne mittaavat valon voimakkuutta vertailu- ja testinäytteen välillä. Kaksikeilaiset koneet mittaavat vertailu- ja testiyhdistettä samanaikaisesti, kun taas yksikeilaiset koneet mittaavat ennen ja jälkeen testattavan yhdisteen lisäämisen.