Western blot -protokolla on tarkka standardi, jolla immunoblot -testi suoritetaan. Western blot -menetelmää käytetään proteiinien havaitsemiseen kudosnäytteestä. Prosessi erottaa natiivit proteiinit määrittämällä polypeptidien pituudet geelielektroforeesilla. Proteiinit siirretään sitten nitroselluloosakalvoon ja tutkitaan vasta -aineilla.
Western blot -protokollan ensimmäinen osa alkaa kudosten keräämisestä. Nämä näytteet kerätään joko elävästä kudoksesta tai soluviljelmästä. Kudos hajotetaan ja siihen lisätään erilaisia estäjiä, kuten proteaasi tai fosfataasi estämään entsyymejä suorittamasta pilkkomista. Tätä protokollan osaa käsitellään yleensä kylmissä lämpötiloissa kudosten säilyttämiseksi.
Geelielektroforeesiprosessi on seuraava vaihe Western blot -protokollassa. Tässä osassa proteiinit tunnistetaan eri tekijöillä, kuten molekyylipainolla tai sähkövarauksella. Tämä prosessi suoritetaan yleisimmin käyttämällä polyakryyliamidigeelejä natriumdodekyylisulfaatin puskurin kanssa. Pohjimmiltaan proteiinit varautuvat negatiivisesti ja siirtyvät kohti positiivisesti varautunutta elektrodia geelin sisällä.
Proteiinien siirto on seuraava osa yleistä Western blot -prosessia. Geelin päälle asetetaan kalvo, jota seuraa suodatinpaperi. Kun sähkövirtaa syötetään, proteiinit vedetään kalvoon. Tätä kutsutaan analyysin todelliseksi “blotting” -osaksi. Kalvot ovat erittäin hauraita ja helposti alttiita vaurioille.
Western blot -protokollan oikea kulku edellyttää sitoutumista. Jotta estettäisiin itse proteiinien saastuminen lisättävillä vasta -aineilla, on toteutettava eräänlainen suojaus. Yleisin estotyyppi käyttää rasvatonta kuivaa maitoa ja pesuainetta. Tämä sitoutuu kalvon avoimiin paikkoihin ja mahdollistaa selkeämmät tulokset, kun vasta -ainetta lisätään.
Havaitseminen on seuraava vaihe oikean protokollan mukaisesti. Proteiinit tuodaan vasta -aineisiin, jotka on liitetty tiettyyn entsyymiin, joka antaa tutkijoille haluttua tietoa. Vasta -ainetta inkuboidaan kalvon kanssa vähintään 30 minuuttia. Tämän jälkeen kalvo pestään ja lisätään toissijainen vasta -aine, joka sitoutuu ensimmäiseen. Usein luminoivaa ainetta käytetään auttamaan tutkijoita tunnistamisprosessissa.
Materiaali pestään uudelleen sitomattomien esineiden poistamiseksi. Värjättyjen nauhojen koon analyysi paljastaa tietoja tietyn proteiinin näkyvyydestä ja laajuudesta. Tämä suoritetaan yleensä muutaman kerran asianmukaisen analyysin varmistamiseksi. Havaitsemisvaihtoehtoja ovat röntgenkuvat, värit ja kemikaalit.