Western blot -vasta-aineet ovat suuria Y-muotoisia proteiineja tai immunoglobuliineja, jotka on tuotettu käytettäväksi Western blot -immuunimäärityksessä, testi siihen liittyvän proteiinin havaitsemiseksi kudosviljelmässä. Monet yritykset ovat erikoistuneet vasta -aineiden tuottamiseen ja toimittamiseen laboratorioille, jotka käyttävät Western blot -menetelmää. Laboratoriossa voidaan tuottaa kahdenlaisia Western blot -vasta -aineita: monoklonaalisia ja byklonaalisia. Valmistetun vasta -aineen menetelmä ja tyyppi riippuvat siitä, miten vasta -aine lisääntyy luonnollisesti isäntäkehossa. Western blot -testin aikana geelielektroforeesiksi kutsuttua prosessia käytetään erottamaan kudosnäytteestä luontaiset proteiinit kohdennetuista Western blot -vasta -aineista, mikä johtaa positiiviseen tunnistamiseen.
Lähes mitä tahansa ainetta voidaan käyttää monoklonaalisen vasta -aineen tuottamiseen, joka sitoutuu siihen liittyvään proteiiniin Western blot -viljelmässä. Polyklonaalisia vasta-aineita tuotetaan suurelta osin samalla tavalla, mutta prosessi on monimutkaisempi, koska vasta-aineet on kerättävä immuuni-B-soluresursseista sen sijaan, että ne yksinkertaisesti kloonattaisiin emosolusta. Kasvavaa teknologiaa immunoglobuliinin tuottamiseksi eri aineista pidetään korvaamattomana työkaluna biokemiassa, molekyylibiologiassa ja lääketieteessä. Western blot -analyysi voi tunnistaa HIV: hen, Lymen tautiin ja Creutzfeldt-Jakobin tautiin-Mad Cow Disease-liittyvät proteiinit, mikä johtaa siihen, että lääkärit voivat tehdä lopullisen diagnoosin aikaisemmin taudin etenemisen aikana. Näiden sovellusten lisäksi oikeuslääketiede voi myös käyttää Western blot -vasta -ainetekniikkaa veri- tai muiden ainenäytteiden tunnistamiseen rikospaikalla.
Sovelluksesta riippumatta kohdennetun proteiinin tunnistaminen kudosnäytteestä alkaa toistamalla tietty määrä vasta -ainetta tunnetusta lähteestä. Monoklonaalisia vasta-aineita voidaan tuottaa olemassa olevasta viljelmästä, mutta prosessi polyklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseksi on huomattavasti aikaa vievämpi. Prosessissa tyypillisesti ruiskutetaan isäntäeläin, kuten hiiri tai vuohi, joko inaktiivisia tai eläviä hiukkasia, jolloin eläimen B-lymfosyytit tuottavat antigeenille spesifisiä immunoglobuliineja. Seuraavaksi näytteeseen lisätään pesuaineita ja puskureita, jotka estävät immunoglobuliinien hajoamisen millä tahansa natiivilla entsyymillä, ja geelielektroforeesia käytetään erottamaan proteiinit molekyylipainon tai isoelektrisen varauksen mukaan. Western blot -vasta -aineet ovat nyt valmiita läpikäymään “blottausprosessin”, joka on vasta -aineiden siirtäminen kalvoon ottaen samalla huomioon siirron aikana tuotetut spesifiset blot -mallit, jotka ovat ainutlaatuisia tunnistetulle proteiinille.