Orgaanisten molekyylien tai aineiden fosforylaatiotaso määritetään kahdella menetelmällä: Western blotting ja massaspektrometria. Fosforylaatio viittaa useimmiten fosfaatin kiinnittymiseen proteiiniin. Kun fosfaatit kiinnittyvät proteiineihin, proteiinientsyymien luonnolliset prosessit ja toiminnot ihmiskehossa häiriintyvät. Fosforylaatiotason määrittäminen on ratkaisevan tärkeää monien sairauksien hoidossa syövästä diabetekseen.
Western blotting on suosittu menetelmä, jota käytetään tietyn proteiinisarjan fosforylaatiotason määrittämiseen. Vasta-aineita, kuten monoklonaalisia anti-fosfo-tyrosiinivasta-aineita, käytetään tyypillisesti, koska ne sitoutuvat helposti proteiinin tyrosiinitähteisiin, joihin fosforylaatio vaikuttaa. Western blotting -menetelmässä proteiinit erotetaan ensin koon avulla käyttämällä sähkövarausmenetelmää, joka tunnetaan geelelektroforeesina.
Sitten proteiinit siirretään kalvoon, joka on peitetty erityisillä vasta -aineilla, jotka sitoutuvat proteiinien fosfaatteihin. Kun proteiinit on siirretty, vasta -aineet tarttuvat kaikkiin proteiineihin, joihin on kiinnitetty fosfaatti. Fosforylaatiotaso voidaan sitten määrittää kalvon röntgenkuvalla. Kaikki vaikuttavat proteiinit antavat valon välähdyksen, mikä helpottaa tutkijan fosforylaatiotasojen mittaamista.
Massaspektrometria on toinen tapa mitata aineen fosforylaatiotasoa. Tämä prosessi muuntaa proteiinimolekyylit ioneiksi, mikä helpottaa niiden seuraamista ja mittaamista. Näyte ionisoidaan suuritehoisella ionilähteellä, joka upottaa näytteen elektroneihin. Tämä toimenpide muuttaa näytteen kationeiksi, positiivisesti varautuneiksi ioneiksi.
Massaspektrometrin massa -analysaattori erottaa ionit niiden massasta ja varauksen voimakkuudesta. Tämän avulla tutkija voi löytää massan ja varauksen suhteen, joka on kriittinen näytteen fosforylaatiotason löytämisessä. Lopuksi ilmaisin mittaa ionit järjestyksessä, jotta tiedot voidaan näyttää kaavion muodossa. Kaavio näyttää x-akselin ionien massa-varaus-suhteen ja y-akselin ionien suhteellisen voimakkuuden.
Fosforylaatiotasot voidaan mitata myös substraatin fosforylaation aikana. Substraatin fosforylaatio on prosessi, joka luo adenosiinitrifosfaattia (ATP), molekyylin, joka on kriittinen energiansiirrolle solujen välillä glykolyysin aikana. Tämä prosessi tapahtuu sekä eläinsoluissa että kasvisoluissa.
Kasvisoluissa ATP -molekyylit luodaan käyttämällä aurinkoenergiaa. Tämä energia kannustaa fosforylaatioon laitoksen kloroplasteissa, kasvien fotosynteesin paikassa. Fosforylaation taso korreloi fosfaattimäärän kanssa, joka tarvitaan uusien ATP -molekyylien luomiseen.