Lontoon skotlantilainen bakteriologi Alexander Fleming löysi erehdyksessä penisilliinin, kun hän yritti tutkia Staphylococcus -bakteereja vuonna 1928. Hän suoritti kokeita bakteereilla Lontoon St.Mary’s Hospitalin laboratoriossa ja asetti bakteerit sisältävän laboratorioastian lähelle avoin ikkuna. Palattuaan kokeeseen hän havaitsi, että jotkut homeet puhalsivat avoimen ikkunan läpi astiaan saastuttaen bakteerit.
Sen sijaan, että heittäisi pois pilaantuneen kokeensa, Fleming katsoi sitä tarkasti mikroskoopin alla. Yllättäen hän ei nähnyt pelkästään homeen kasvavan bakteereilla, vaan myös selkeän alueen muotin ympärillä. Penisillium -home, penisilliinin edeltäjä, liuotti tappavat Staphylococcus -bakteerit.
Fleming oli alun perin optimistinen siitä, että penisilliini olisi hyödyllinen antibakteerisena aineena, koska se oli turvallinen ihmiskeholle, mutta voimakas. Myöhemmin, vuonna 1931, hän muutti mieltään ja päätti, että se ei kestä ihmisissä haitallisten bakteerien tappamiseen tarvittavaa aikaa, ja lopetti sen tutkinnan. Vuonna 1934 hän aloitti muutaman vuoden kliiniset tutkimukset ja yritti löytää jonkun muun puhdistamaan sen.
Englannin Oxfordin yliopiston tutkijat, mukaan lukien Howard Florey, Ernst Chain ja Norman Heatley, kokeilivat Flemingin löytöä. He osoittivat, että penisilliini olisi sekä vaaratonta että tehokasta hiirillä, mutta sillä ei vielä ollut tarvittavaa määrää ihmisten hoitoon. Orvan Hess ja John Bumstead olivat ensimmäiset ihmiset, jotka käyttivät sitä potilaan onnistuneeseen hoitoon.
Penisilliini pelasti monien sotilaiden hengen toisessa maailmansodassa, mutta tarjonta oli erittäin vähäistä ja lääke erittyi nopeasti kehosta, joten potilaita oli annosteltava usein. Tässä vaiheessa oli yleinen käytäntö säästää virtsa potilailta, joita hoidettiin, jotta penisilliini voitaisiin eristää ja käyttää uudelleen. Toisen aineen, probenesidin, havaittiin lopulta pidentävän penisilliinin kestoa ihmiskehossa.
Fleming, Florey ja Chain saivat lääketieteen Nobel -palkinnon vuonna 1945 penisilliinin löytämisestä ja kehittämisestä. Florey oli avoimesti huolissaan väestön räjähdysmahdollisuudesta, joka johtuu terveydenhuollon parannuksista, ja sanoi, että hänen työnsä antibiootin kanssa oli enemmän mielenkiintoinen tieteellinen ongelma kuin tapa auttaa ihmisiä. Hän myönsi, että se, että se voisi auttaa ihmisiä, oli hyvä asia, mutta ei miksi hän oli alun perin kiinnostunut.
Andrew J.Moyer myöhemmin löysi kuinka valmistaa suuria määriä penisilliiniä, patentoi prosessin ja edisti tartuntatautien torjuntaa. Vuonna 1987 hänet valittiin National Inventors Hall of Fameen, koska hän loi suuria määriä penisilliiniä.