Proteiinipitoisuuden määrittämiseen on satoja erilaisia menetelmiä. Biokemistien analysoimien proteiiniliuoksetyyppien uskomaton monimuotoisuus on syy siihen, miksi ei ole olemassa yhtä yleistä menetelmää, joka toimisi kaikentyyppisille proteiiniliuoksille. Yleisimmät proteiinimääritykset ovat Bradford -määritys, Lowry -määritys ja bicinchoninic -happomääritys. Siitä huolimatta on kehitetty lukemattomia muunnelmia tarpeen mukaan proteiiniliuoksen ja määrityksessä käytettävien reagenssien mahdollisten kemiallisten yhteensopimattomuuksien välttämiseksi.
Yleisesti ottaen proteiinikonsentraation määrittämiseen on kaksi pääkokeiden ryhmää. Ensimmäisessä menetelmäryhmässä värillinen tai fluoresoiva väriaine lisätään proteiiniliuokseen ja se sitoutuu spesifisesti proteiiniin. Sitoutuneen väriaineen ainutlaatuinen absorptioaallonpituus on verrannollinen proteiinin määrään. Käyttämällä spektrometriä on mahdollista arvioida proteiinin pitoisuus.
Toinen määritysryhmä sisältää kupari (II) -ionien lisäämisen proteiiniliuokseen, jossa nämä ionit pelkistetään kupari (I) -ioneiksi. Nämä pelkistetyt ionit kykenevät sitten muodostamaan värikkäitä komplekseja sitoutumalla proteiineihin. Mittaamalla absorbanssit niiden ainutlaatuisilla aallonpituuksilla voidaan myös päätellä proteiinikonsentraatiot.
Yksi suosituimmista proteiinipitoisuuksien määritysmenetelmistä on Bradford -määritys. Tässä määrityksessä punaista väriainetta nimeltä coomassie brilliant blue lisätään proteiiniliuokseen happamissa olosuhteissa. Koska tämä väriaine sitoutuu proteiiniin, se muodostaa pysyvän sinisen kompleksin, jolla on ominainen absorbanssi 595 nanometrillä.
Huolimatta Bradford -määrityksen yleisestä monipuolisuudesta, se ei ole yhteensopiva joidenkin proteiiniliuoksien kanssa. Erityisesti Bradfordin määritys häiritsee natriumdodekyylisulfaatin (SDS) läsnäoloa, pesuainetta, jota käytetään yleisesti proteiinien puhdistamiseen ja solujen hajottamiseen hajoamisen avulla. Tämä pesuaine häiritsee väriaineen sitoutumista proteiineihin, mikä johtaa epäluotettavaan ja virheelliseen absorptiolukemaan. Muita menetelmiä on siis käytettävä, kun käyttöturvallisuustiedote on läsnä.
Toinen proteiinimäärityssarja on kehitetty, ja ne kaikki sisältävät muunnelman Biuret -testistä. Tässä reaktiossa proteiini yhdistetään vesipitoisen emäksen ja kupari (II) -ionien kanssa. Nämä ionit pelkistyvät ja kelatoivat sitten proteiinilla muodostaen värikkäitä komplekseja. Kaksi tätä testiä käyttävää määritystä ovat Lowry -määritys ja bicinchoninic acid -määritys.
Lowry-määrityksellä Folin-Ciocalteu-reagenssi lisätään Biuret-testiin. Folin-Ciocalteu-reagenssi hapettaa aromaattiset jäännökset, erityisesti tryptofaanin, ja auttaa kompleksia imeytymään voimakkaasti 750 nanometrin kohdalla. Binokoniinihappomääritys puolestaan sisältää bikinokonihapon lisäämisen Biuret -testiin. Lyhyen inkuboinnin jälkeen noin 104 ° Fahrenheitissa (40 ° C) kaksi ekvivalenttia happoa ja proteiinin peptidisidokset kelatoivat yhden kupari (I) -ionin. Tuloksena on kompleksi, joka absorboi voimakkaasti 562 nanometriä.
Kun valitaan menetelmä proteiinikonsentraation määrittämiseksi, on tärkeää ottaa huomioon liuoksessa olevat erilaiset kemialliset funktionaaliset ryhmät. Tiettyjen aminohapposivuketjujen, disulfidisidosten ja kofaktorien läsnäolo voi tehdä proteiinikonsentraation määrittämisestä villin epätarkan. Usein on tarpeen ottaa huomioon paitsi proteiinit myös muut reagenssit ja puskurit, kuten pelkistävät ja pesuaineet. Ihanteellinen menetelmä on kemiallisesti yhteensopiva sekä luotettava, halpa ja helppo asentaa.